Gwałtowny rozwój nauki, jaki ma miejsce od ponad stu lat, a niezwykle przyspieszył w ostatnich 30 latach, jest faktem niezaprzeczalnym. Jednymi z najszybciej rozwijających się dziedzin są nauki medyczne, biologiczne oraz chemiczne. Dzięki nowoczesnym metodom analitycznym oraz izolacyjnym, naukowcy odkrywają kolejne sekrety i tajemnice natury. W konsekwencji fitochemicy dysponują setkami nowych, nieznanych dotąd substancji lub są w stanie otrzymać znane i stosowane w lecznictwie związki naturalne w większej niż dotychczas ilości. Kolejnym, niezwykle istotnym, etapem badań jest stwierdzenie właściwości biologicznych substancji otrzymanych z roślin, produktów pszczelich, grzybów lub organizmów morskich. Większość badań farmakologicznych aktywnych substancji roślinnych prowadzona jest na gryzoniach (głównie myszach i szczurach) i jest czasochłonna oraz obarczona wysokimi kosztami prowadzonych eksperymentów. Wynikają one z pochłaniającej wysokie nakłady hodowli odpowiednich zwierząt laboratoryjnych. Dodatkowe trudności wynikają z konieczności organizacji przestrzeni do hodowli oraz badań. Od lat poszukiwano zatem taniego, łatwego w hodowli, zajmującego niewielką przestrzeń „kandydata” na model zwierzęcy, który byłby stosowany w badaniach przesiewowych.
Mała rybka z Indii
Takim idealnym organizmem modelowym okazała się mała, smukła rybka z rodziny karpiowatych danio pręgowany (Danio rerio), występująca w stanie naturalnym w rzekach na terenie Indii, Pakistanu oraz Nepalu. Danio pręgowany zawdzięcza swoją nazwę i urodę pięciu równoległym, niebieskim pasom biegnącym wzdłuż grzbietu. Ta cecha powoduje skojarzenia z ubarwieniem zebry, co oddaje angielska nazwa tego gatunku (zebrafish). Ta tropikalna słodkowodna ryba posiada wszystkie cechu idealnego organizmu modelowego. Danio pręgowany stał się ulubionym organizmem do badania rozwoju embrionalnego ze względu na niewielkie rozmiary oraz łatwość hodowli. Co jest niezwykle istotne, rozwój tej niezwykłej rybki przypomina bardzo embriogenezę wyższych kręgowców, w tym ludzi. Z uwagi na to, że proces odbywa się poza organizmem samicy, a jajo otoczone jest przeźroczystą osłonką, możliwość śledzenia zmian jest w znacznym stopniu ułatwiona. Równie ważne jest to , że same zarodki są przezroczyste w okresie pierwszych kilku dni życia.
Kolejną zaletą danio pręgowanego jest jego niezwykle szybki rozwój oraz wysoka płodność. Zaledwie po 12 tygodniach życia, dorosłe już osobniki gotowe są do dalszej reprodukcji i tworzenia następnego pokolenia. Samice składają zwykle 200 – 300 jaj tygodniowo. Okres embrionalny kończy się w 3 lub 4-tym dniu po zapłodnieniu wylęganiem larwy, której rozwój trwa około 6 tygodni. W tym czasie następuje znaczący przyrost ryby oraz wykształcenie płetw i charakterystycznej pigmentacji. Już po kilku dniach życia larwa swobodnie pływa, posiada zdolność reakcji na bodźce i wykazuje pełne spektrum reakcji behawioralnych, co jest niezwykle przydatne w badaniach skomplikowanych procesów fizjologicznych, jak i zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Ciekawym faktem jest to, że dorosłe osobniki danio pręgowanego wykazują wiele zachowań wyższego rzędu takich jak pamięć, odruchy warunkowe czy różnorodne zachowania społeczne. Małe rozmiary, duża liczba potomstwa i niezbyt wygórowane wymagania dotyczące warunków hodowli umożliwiają przeprowadzenie doświadczeń o wysokiej przepustowości. Powoduje to zmniejszenie zużycia substancji niezbędnej do testów, mniejsze ilości zużytych odczynników oraz ograniczenie niezbędnego czasu na eksperymenty. Możliwość znacznego zwiększenia wielkości próby, ułatwia również ocenę statystyczną i wpływa na jej istotność. Właściwości te przydatne są np. przy testowaniu danej aktywności farmakologicznej kilkudziesięciu (lub więcej) substancji w dodatku w różnych dawkach. Wykorzystuje się do tego płytki wielodołkowe (24,48, 96-ściodołkowe lub o większej ilości dołków) oraz zaawansowane systemy ułatwiające obserwacje i rejestrację eksperymentu oraz obliczanie dokładnych wyników.
Danio rerio jest wykorzystywany z powodzeniem w badaniach dotyczących mechanizmu powstawania i możliwości leczenia chorób nowotworowych, różnorodnych zaburzeń genetycznych, schorzeń układu krwionośnego, kostnego czy wielu innych. Jednak szczególnie predestynowany i z powodzeniem wykorzystywany jest w badaniach, próbujących wyjaśnić podłoża chorób związanych z zaburzeniami ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Równie przydatny jest do oceny aktywności substancji pochodzenia naturalnego względem struktur (OUN) i chorób związanych z ich nieprawidłowym funkcjonowaniem takich jak depresje, padaczki, choroby neurodegeneracyjne (w tym choroba Alzheimera) oraz różnorodne stany lękowe.
Wynika to z faktu, iż pomimo różnic w budowie anatomicznej układu nerwowego ryb oraz ssaków, danio pręgowany posiada wszystkie najważniejsze struktury występujące w mózgu ssaków (lub ich funkcjonalnych analogii). Ponadto duży stopień podobieństwa między Danio rerio a organizmami wyższymi występuje w zakresie podstawowych neurotransmiterów, receptorów oraz enzymów odpowiedzialnych za syntezę i metabolizm neuromediatorów, których dysfunkcja odpowiada za rozwój chorób psychicznych. Duże znaczenie ma też wysoki stopień zgodności genetycznej pomiędzy danio pręgowanym a człowiekiem, co umożliwia poszukiwanie potencjalnych genów, które mogą być odpowiedzialne za wystąpienie danej choroby. Badanie ich poziomu ekspresji, nie tylko może potwierdzić aktywność testowanej substancji naturalnej na poziomie molekularnym, ale też wyjaśnić dokładnie mechanizmy na poziomie komórkowym leżące u jej podstaw.
Przelękniona cywilizacja
Współczesna cywilizacja z ciągłym zabieganiem, brakiem czasu, nieustannie atakującymi ze wszystkich stron bodźcami oraz ogólnym poczuciem niepewności powoduje, że wiele osób dotkniętych jest różnymi stanami lękowymi. Liczba osób dotkniętych patologicznym lękiem może budzić przerażenie. Zwłaszcza w obliczu danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), które podają, że około jedna trzecia mieszkańców krajów wysokorozwiniętych miała w swoim życiu przynajmniej jeden epizod lęku, który ze względu na intensywność bądź okres trwania stanowił poważny problem zdrowotny. Zdaniem wielu specjalistów dane te wydają się być niedoszacowane, a zaburzenia lękowe towarzyszą często innym chorobom i/lub przyjmują formę przewlekłą. Różnorodne stany lękowe są dużym wyzwaniem dla współczesnej medycyny, ponieważ ich negatywne skutki dotykają zarówno osoby, które cierpią z powodu efektów somatycznych tych zaburzeń (skutki na poziomie jednostkowym) oraz zaburzają kontakty z rodziną i innymi ludźmi (skutki społeczne). Innym aspektem są olbrzymie koszty wynikające z nieobecności osób chorych w pracy, ich mniejszej efektywności oraz wydatki na leczenie, które sięgają w samej Unii Europejskiej dziesiątek miliardów euro. Odpowiedzią współczesnej medycyny jest farmakoterapia, która bazuje na kilku grupach leków przeciwlękowych (anksjolityków), wśród których najczęściej stosowane są benzodiazepiny. Mimo wysokiej skuteczności tych leków oraz dużej „popularności” wśród pacjentów, obarczone są one wieloma działaniami niepożądanymi takimi jak senność, zaburzenia równowagi, osłabienie siły mięśniowej, zaburzenia pamięci czy bóle głowy. Dodatkowo w przypadku stosowania anksjolityków należących do grupy benzodiazepin rozwija się tolerancja i może wystąpić uzależnienie.
Z uwagi na pilną potrzebę poszukiwania substancji o działaniu przeciwlękowym, zarówno skutecznych jak i bezpiecznych, naukowcy sięgają po rośliny lecznicze i związki aktywne w nich obecne, czego dobrym przykładem jest korzeń kozłka lekarskiego (Valerianae radix). Po środki lecznicze pochodzenia naturalnego sięgają też często pacjenci, zwłaszcza w początkowym etapie schorzenia lub jako terapię uzupełniającą w późniejszym okresie choroby.
Zielone anksjolityki
Liczne badania na zwierzętach potwierdziły, że powszechnie występujące w tkankach roślinnych związki naturalne, należące do kumaryn, wykazują działanie przeciwlękowe (anksjolityczne). Wykazywały je zwłaszcza furanokumaryny (np. imperatoryna) obecne w różnych organach, a zwłaszcza owocach i korzeniach, arcydzięgla lekarskiego (Archangelica officinalis). Również ekstrakty roślinne zawierające cały zespół kumaryn charakteryzowały się dużą skutecznością. Szczególnie interesującym i dobrze prognozującym na przyszłość jest fakt, że efektywne dawki zbliżone były do dawek leków syntetycznych (np. diazepamu).
Związki należące zarówno do furanokumaryn, kumaryn prostych lub piranokumaryn wykazywały aktywność względem centralnego układu nerwowego (działanie przeciwdrgawkowe, antyneurodegeneracyjne, inhibicja acetylocholinoesterazy).
Działanie to było z jednej strony wynikiem unikalnych właściwości kumaryn, takich jak odpowiednia lipofilność i zdolność do przekraczania bariery krew-mózg, a z drugiej na interakcji z systemem neuroprzekaźników w centralnym układzie nerwowym (zwłaszcza z układem GABA-ergicznym związanym z kwasem γ-aminomasłowym).
Jak danio wpływa na badania nad lękiem?
W oparciu o tak zachęcające wyniki dotyczące anksjolitycznej aktywności kumaryn naukowcy z Katedry Farmakognozji lubelskiego Uniwersytetu Medycznego prowadzili badania obejmujące swym zakresem poszukiwanie związków kumarynowych w roślinach z rodziny Apiaceae, ich izolację z materiału roślinnego oraz określenie aktywności przeciwlękowej. Badania finansowane były przez Narodowe Centrum Nauki, w ramach grantu Preludium Kumaryny jako potencjalne substancje o działaniu przeciwlękowym (2017/25/N/ NZ7/01899).
Modelem zwierzęcym, na którym przeprowadzono ocenę wpływu kumaryn na zachowania lękowe, były 5-dniowe larwy danio pręgowanego. Przed przystąpieniem do testu przygotowano serię stężeń badanego związku w zakresie od 1,5 μM do 30 μM. Następnie umieszczono po 1 larwie Danio rerio w każdym dołku 24-dołkowej płytki titracyjnej Po usunięciu nadmiaru płynu przeniesionego wraz z rybą, dodano 1, 5 ml badanego roztworu zawierającego rozpuszczoną testowaną kumarynę (lub inny testowany związek naturalny) w odpowiednim stężeniu. Tak przygotowaną płytkę poddano, przed właściwym eksperymentem, inkubacji trwającej 30 minut. Pierwsze trzy dołki każdej płytki wypełnione były 1% roztworem DMSO w płynie E3 (kontrola negatywna), w trzech kolejnych znajdował się roztwór diazepamu o stężeniu 10 μM (kontrola pozytywna). Kolejne rzędy płytki (po 6 dołków) przeznaczone były dla danego stężenia testowanej substancji. Po zakończonej inkubacji płytkę przeniesiono do odpowiedniego aparatu, który posiadał system monitorujący aktywność larw oraz sterujący warunkami eksperymentu (zmienne oświetlenie, temperatura). System podłączony był do komputera, wyposażonego w oprogramowanie służące do analizy behawioryzmu larw. Wpływ badanych substancji na zachowania lękowe u 5-dniowych larw Danio rerio oceniano wykorzystując zjawisko tigmotaksji. Jest to preferencja zwierząt do pozostawania w pobliżu granic (na obrzeżach) nowego środowiska. Zachowanie takie świadczy o występowaniu lęku. Zwiększony czas przebywania w strefie centralnej danego środowiska (pomieszczenia) oraz większy dystans przebyty w tej strefie, świadczą o zmniejszeniu się (lub wygaszeniu) stanów lękowych, a więc aktywności przeciwlękowej (anksjolitycznej ) badanej substancji. Zjawisko to można obserwować też u wyższych kręgowców (w tym ludzi), kiedy wchodząc do nowego pomieszczenia staramy się trzymać raczej ścian niż wkraczać na jego środek. Czynnikiem wywołującym lęk w eksperymencie było zmienne światło (10 minut oświetlenia, 5 minut ciemności w trzech cyklach).
W doświadczeniu wykorzystano oprogramowanie do analizy behawioryzmu larw, które podzieliło obszar każdego dołka płytki (pod względem pomiarowym) na część wewnętrzną, zajmującą 50% całego obszaru oraz część zewnętrzną. Opierając się na zachowaniu jakim jest tigmotaksja, badano procent czasu spędzonego w środkowej arenie (tzw. odwrócona tigmotaksja). W ramach projektu przebadano kilkadziesiąt ekstraktów roślinnych zawierających kuamaryny oraz kilkanaście wyizolowanych czystych związków. W przypadku związków o największej aktywności przeciwlękowej, zbadano ich wpływ (wykorzystując Danio rerio jako organizm modelowy) na ekspresję genów związanych z układami neuroprzekaźników związanych z powstawaniem i wygaszaniem stanów lękowych oraz aktywnością neuronów. Te innowacyjne badania zostały przeprowadzone we współpracyz Laboratorium Genomiki i Transkryptomiki, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie.
Czy danio pręgowany wypłynie ( i wpłynie?) na szerokie wody nauki?
Pytanie należy do grupy pytań retorycznych. Mimo, że Danio rerio jako organizm modelowy używany jest stosunkowo krótko, to zdobywa coraz większą popularność. Jego „elastyczność”, niskie koszty badań oraz ich szeroki zakres powodują, że zwiększa się gwałtownie liczba badań wykorzystujących ten organizm. Jedną z przyczyn jest obniżenie kosztów, ułatwienie i przyśpieszenie początkowego etapu badań aktywności danych związków, kiedy spośród kilkudziesięciu czy kilkuset substancji, wyciągów czy frakcji do dalszych badań trzeba wybrać tych kilka najaktywniejszych, najbardziej obiecujących. Skraca to znacznie żmudny proces poszukiwania nowych substancji leczniczych, z korzyścią dla nauki i społeczeństwa. W celu nawiązywania i utrzymywanie współpracy naukowej w badaniach z użyciem danio pręgowanego jako organizmu modelowego oraz propagowanie tego modelu w społeczności naukowej w Polsce, powstało Polskie Towarzystwo Zebrafish (zebrafish.org.pl). Ważnym elementem misji Stowarzyszenia jest też m.in. edukowanie społeczeństwa o wszelkich badaniach naukowych z użyciem tego organizmu modelowego.
